KPC
Assunto atual que se torna importante, pelo fato de termos notícias do aumento de casos diagnosticados ultimamente, nos hospitais de todo o país. Desse modo, torna-se preocupante e leva-nos, os profissionais da saúde, a tomar maior cuidado com o nosso proceder de higienização e proteção pessoal, e nos cuidados de pacientes especialmente os em isolamento. A precaução na manipulação de materiais, objetos cirúrgicos e de uso diversos, a manutenção asséptica preventiva dos equipamentos indispensáveis, é de suma importância, o precaver, é na essência muitas vezes melhor e superior a antibioticoterapia da pós infecção. O cuidado ao manipular secreções coletadas e transportadas para análise laboratorial, deve seguir os mesmos procedimentos. É de extrema importância, o modo de se proceder “do corpo” médico, da enfermagem e do grupo técnico de laboratório, com relação á contatos com os pacientes portadores. A irreverência ou alienação de qualquer profissional, ou o fato de descumprir procedimentos preventivos higiênicos e assépticos, por parte daquele que cuida do enfermo, este pode passar a ser o veículo transmissor para outros pacientes do mesmo local, ou pode ampliar a disseminação e até mesmo para os membros da própria família, e daí, desse foco, ser o protagonista da disseminação geral entre a população, da cepa contaminante e altamente patogênica que questionamos. É bom estarmos esclarecidos a respeito, para um controle mais eficaz da doença.
A Bactéria KPC
A bactéria, cepa resistente à antimicrobianos, KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase) é uma enterobactéria Gram negativa (se cora em vermelho, pelo corante safranina) que por mutação genética se tornou resistente especialmente aos carbapenêmicos.
Porque KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase)
Dentre as formas dessa bactéria se tornar resistente à antibióticos, a cepa com o gene KPC produz a enzima betalactamase ou carbapenemase que degrada, ou hidrolisa os antibióticos da classe dos carbapenens, que são: o imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, esses antibióticos utilizados no tratamento de patologias causadas por enterobactérias de caráter resistente a múltiplos antibióticos.
Os Plasmídios e a Resistência Bacteriana
Os plasmídios são moléculas, ou integrons presentes na KPC, e se dividem em três classes, O integron verona metallo-beta-lactamase (VIM), Nova Delhi metallo-beta-lactamase (NDM) e o imipenemase-metallo-beta-lactamase (IMP). Os plasmídios ou integrons (normalmente a bactéria seleciona um único tipo de plasmídio) são os portadores das informações que levam a produção da chamada enzima carbapenemase, que possibilita a inativação de antibióticos. Os Integrons são moléculas de DNA circular extracromossomial bacteriana, com capacidade de reprodução própria, estão localizados no citoplasma da bactéria, eles também são pertencentes ao grupo dos mecanismos de produção da resistência bacteriana. São fáceis de passarem de uma bactéria ou de uma cepa para outra, sendo assim, podem se combinar facilmente com o novo cromossomo bacteriano. São capazes de gerar rapidamente novas recombinações, nesse caso, o que dá resistência a antibióticos.
A Morfologia da Bactéria de Gênero Klebsiella
e a Implicância na Agressividade
Um Dos Fatores Que Proporcionam o Aumento de Sua agressividade
Para termos uma noção mais clara, do que a levou essa bactéria a apresentar o potencial de patogenicidade tão alta, devemos ter uma noção da sua estrutura física, um dos fatores diretamente relacionado, que a torna um germe quase indestrutível por ação de antibióticos.
As bactérias do gênero Klebsiella apresentam-se na forma de bastonetes Gram negativos imóveis, que além das suas paredes bacteriana de proteção, conta com uma cápsula de polissacarídios bem constituída, que lhe dá uma aparência aumentada de seu tamanho, recobre completamente toda a sua superfície externa, e lhe serve de proteção contra muitos mecanismos de defesa do hospedeiro.
É de conhecimento dos profissionais da área, que em todo o gênero, existem por volta de 77 antígenos K, e 9 antígenos do tipo O. Todos eles servem para a classificação dos seus vários sorotipos. Sabe-se também que, os membros do gênero Klebsiella mais infectantes caracteristicamente expressam esses dois tipos de antígenos de estruturas variáveis, um localizado na sua superfície estrutural celular, especificamente, na parede celular, o lipopolissacarídio antígeno O e um outro presente na sua cápsula localizada externamente, o polissacarídio capsular o antígeno K.
É característica desses dois fatores aumentarem a virulência da bactéria.
O Que a KPC Causa
Pneumonia em imunocomprometidos e também em diabéticos, infecções, do trato urinário, pode atacar feridas cirúrgicas e evoluir para um caso com complicações gerais do estado de saúde e ser até mortal.
Onde a Klebsiella Pode Ser Encontrada e a KPC?
Normalmente a bactéria do gênero Klebsiella habita o intestino humano sem causar nenhuma infecção. Podem habitar na água, no solo, nas fezes, nos cereais, nos vegetais e frutas.
Como Pode Ser Feita a Transmissão ou Como Podemos Nos Contaminar
O ambiente hospitalar onde se encontram os portadores da bactéria, é o lugar mais lógico da presença da KPC, o contato com as secreções ou excreções desses pacientes infectados, ou colonizados sem os cuidados da autoproteção necessária, é o óbvio para se obter resultados indesejáveis quanto à preservação da própria saúde. Mas também é necessário pensar num ambiente não hospitalar, das possibilidades de como pode acontecer a transmissão do agente patológico, que pode ser através de diversas condições. A contaminação aconteceria ao ingerir alimentos preparados sem o cuidado de lavar muito bem as mãos antes de prepará-los. Outra possibilidade que levaria a acontecer o contato com o microrganismo está muito em alta atualmente, pela necessidade dos pais, que trabalham fora e confiam nas creches ou escolas o cuidado de seus filhos. Acontece que essas instituições acabam abrigando um grande número de indivíduos, nesses ambientes como em qualquer lugar, as crianças naturalmente brincam muito, se tocam inumeráveis vezes, nesse caso, devem ser ensinadas a fazerem higiene pessoal, as mãos, e é claro, todo o corpo dessas crianças deve estar bem limpo, e isso não deve acontecer apenas nesses lugares específicos, pois; mesmo na sua própria casa, frequentemente a criança toca a si própria a todo momento, tocam os próprios olhos, a boca e as narinas etc. Até nós adultos fazemos isso “mecanicamente” sem percebermos. Pessoas com ferimentos expostos protegidos por ataduras, não importa em que ambiente estejam, em casa ou no ambiente hospitalar, precisam trocar essas ataduras de proteção frequentemente e assepticamente. Outra precaução que todos nós devemos ter, é trocar as roupas, depois de estarmos em contato com lugares públicos em geral por exemplo, durante todo um dia de trabalho, da mesma forma, devemos ainda, ter o cuidado de lavar bem as mãos após o uso de banheiros, principalmente nos lugares públicos. Ao usar aparelhos de necessidade pessoal, que está sempre próximos a nós mesmos, a todos os momentos, como controle remoto, celular, tablet, iPad, etc. Devemos lavar frequentemente as mãos, para que o objeto não seja impregnado e não se torne um veículo contaminado e contaminante. Roupas de cama devem ser trocadas de acordo com o tempo necessário de uso, especialmente as do ambiente hospitalar. O não comprimento das regras de higienização desses itens mencionados, pode ser um fator para aquisição de agentes patogênicos em geral e também da KPC.
Pessoas Que São Mais Susceptíveis à Doença
Crianças, idosos, e imunodeprimidos, pessoas internadas por longo tempo nos diversos ambientes hospitalares. Nas UTIs, nesses locais, os pacientes podem estar sujeitos várias portas de entrada para infecções, tais como o uso de sonda vesical de demora, cateter venoso central, tubo orotraqueal, cânula de traqueostomia, intracath, e às vezes pelo tempo de permanência imóvel em posições determinadas, formam feridas de decúbito, que se tornam vias de acessos de microrganismos.
Sintomas Apresentados
Os sintomas são parecidos com uma infecção comum, na infecção da corrente sanguínea pelo microrganismo o indivíduo pode apresentar febre alta, ou hipotermia, taquicardia, prostração, dores no corpo. Nos casos de alta gravidade apresenta hipotensão, inchaço e falência de órgãos. Na infecção urinária apresenta dores, especialmente na bexiga, quanto ao aparelho respiratório ao ser atingido, o indivíduo pode apresentar alteração do quadro respiratório com tendência a piora, tosse, falta de ar, no caso de pneumonia, mesmo sendo uma bactéria de cepa Klebsilla penumoniae comum, pode comprometer o órgão com Inflamação pulmonar, formação de uma camada de muco na superfície atingida, e pode por vários modos progredir para hemorragia local, necrose celular e tecidual o que leva o paciente a sentir muita falta de ar, e terminar com morte.
Como a Doença é Diagnosticada
Do ponto de vista clínico os sintomas apresentados pelo paciente é semelhante a uma infecção comum. O diagnóstico é feito no por análise laboratorial, com material retirado do sistema digestivo ou de outro foco localizado no paciente.
Para análise laboratorial o material coletado deve ser encaminhado o mais rapidamente possível. Coleta de material para cultura pode ser o aspirado de secreção endotraqueal, ou secreção pulmonar, secreção de dreno, lavado bronco-alveolar ou brônquico, ponta de cateter, de região perianal, coletar com swab, nas infecções da corrente sanguínea, deve ser feita a coleta de sangue em frascos específicos, para realizar a hemocultura. Na infecção urinária, após assepsia, coletar o jato médio de urina em frasco estéril ou por punção supra púbica, ou saco coletor, a urina deve ser semeada imediatamente no meio de cultura específico, para analise do sistema gastrintestinal, colher material para coprocultura, material de feridas, seja cirúrgica ou não, de localização em pontos externos acessíveis, colher com swab e meio de nutrientes enriquecido,
Como Prevenir a Doença
Qualquer pessoa deve-se precaver quando for necessário entrar em contato com pacientes que carregam a infecção, ou os com forte suspeita da infecção. Os cuidados com a limpeza e desinfecção das superfícies que o doente entrar em contato é de extrema importância. Nos hospitais os pacientes devem ser isolados. Restringir as visitas ao paciente por necessidade, caso a pessoa obtenha direito a visita, esta deve ser orientada das precauções a serem tomadas para que não seja contaminada e se torne disseminadora. Desse modo deve ser feito um controle do número de visitas, o visitante deve evitar tocar o enfermo ou objetos e móveis do quarto em que o paciente está. De um modo geral, todo indivíduo deve lavar as mãos frequentemente com bastante sabão, e fazer desinfecção com álcool gel, o pessoal da área da saúde deve usar luvas, máscaras, ao fazer contato com o indivíduo portador, ou com objetos, vestuário, roupas de cama do mesmo, ou do material coletado para exames de diagnóstico.
Outro procedimento de extrema importância é não fazer uso de medicamentos contra esses microrganismos sem controle médico, é desse modo que a bactéria adquire resistência à antibióticos.
A Hidrolisação e Inativação de Medicamentos
Segundo o Journal of Antimicrobial Chemotherapy de Oxford, a enzima betalactamase produzida pela bactéria KPC, agora é capaz de hidrolisar e inativar os medicamentos de largo espectro, os quais eram nas mãos dos médicos o último cartucho a ser disparado, ou um dos últimos recursos utilizados na antibioticoterapia para micróbios Gram negativos multi resistentes. Como o grande número de antibióticos de escolha, anteriormente foram reduzindo, ou sendo restritos cada vez mais para o controle das Gram negativas, por causa da diminuição da sensibilidade ou aquisição de resistência contra a ação de combate á essas infecções, dos muitos antibióticos que antes eram usados, sobraram os betalactâmicos de largo espectro, que foram sendo utilizados cada vez mais no controle desses agentes infecciosos. No entanto, esses medicamentos utilizados nas cepas selvagens patogênicas, que inclui também o gênero da Klebsiella, esses medicamentos do grupo dos β-lactâmicos, em conjunto com outros como as penicilinas, as cefalosporinas, os carbapenens e o monobactam, também já sofrem o processo de resistência por parte dessa bactéria, que atua pela clivagem do anel beta-lactâmico da estrutura molecular desses medicamentos, pela ação da enzima betalactamase, da bactéria mutagênica KPC, inativando suas ações.
Tratamento - Medicamentos
Atualmente a escolha dos medicamentos é muito restrita, e o tratamento é realizado com a associação de três antibióticos: polimixina B, tigerciclina e amicacina, ou em conjunto com os aminoglicosídeos.
As cefalosporinas também são usadas no tratamento, sendo antibióticos beta lactâmicos de amplo espectro. Por exemplo: as cefalosporinas de primeira geração, possuem baixa toxicidade, podem ser utilizadas até na gravidez, no entanto podem ocorrer reações alérgicas semelhantes aos medicamentos do grupo das penicilinas; a cefalotina, cefazolina, cefalexina, cefadroxila.
Bibliografia
[PDF] NOTA SOBRE A KLEBSIELLA PNEUMONIAE PRODUTORA DE ... www.saude.mt.gov.br/.../nota_estadual_sobre_klebsiell..
Detection and treatment options for Klebsiella pneumoniae ...
jac.oxfordjournals.org/content/65/6/1119.short
H.P. Rang, M.M. Dale, J.M Ritter Farmacologia, quarta edição. Guanabara Koogan 2001.
Pesquisa bibliográfica, texto - Prof. Antonio Sp Rocha.
Mensagem
Mensagem Especialmente Dirigida aos Meus Alunos.
Recomeçamos novamente o ano letivo, apreensivos sobre os desafios eminentes perguntamos a nós mesmos, quais serão as novas expectativas que surgirão tanto para professores como para os alunos? A pergunta que o aluno poderá fazer será: o que vou fazer durante este ano? O que posso esperar do professor? Por sua vez o professor, o que espera do aluno? Há esperanças concretas! Ou a escola é apenas um “lócus” de encontros com amigos, chat de bate-papos? Ou mais seriamente indagando na sobriedade de seu íntimo, é um esperar a aquisição de conhecimentos? Mas é possível adquirir algo importante sem lutas? Esperar não é tudo e o resultado que cada um obtiver será proporcional ao que individualmente realizar, cada um deverá “arregaçar as mangas” e fazer a sua parte. Outra pergunta que o aluno também poderá fazer é a seguinte; para que serve o ensino médio?
Para que servirá o curso que eu estou fazendo. Eu poderia responder através de simples palavras que o ensino médio é o aprendizado da universidade, é a transformação do inculto no culto, é o absorver ensinamentos que estão acumulados pela humanidade por séculos ou milênios, é a fase preparatória, é o “conhecimento global” é o universo entrando numa fase de sua vida, é o contato com diversas áreas da ciência, que o levará a definir por sua escolha a sua profissão efetiva que perdurará praticamente por toda a sua vida, é a preparação para um aprofundamento a alçar no seu desenvolvimento posterior o nível de superioridade intelectual, de conhecimentos profissionais. Finalmente, o ensino médio é a abertura de portas para se conseguir empregos e concursos públicos da categoria.
Há alguns indivíduos que demonstram sua pouca personalidade em formação, somados a falta de educação “de berço” que alguns não possuem, traz para dentro da sala de aula seus reflexos negativos e apatias acumulados, como “genes montadores de seus grupos sociais limitados na convivência restrita aos seus mundinhos” são exemplos os quais não devem ser seguidos pelos demais, pois além de tudo esses mesmos trazem consigo certa arrogância petulante, característica própria da idade jovial em desenvolvimento físico-psicológico conflitante no humano pouco instruído. São como estrelas cadentes sem rumo, por se sentirem jovens fortes, capazes, senhores dos seus próprios atos, ignoram a necessidade da formação acadêmica, esses; não se empenham em fazer um aprendizado razoável para si próprio nessa fase especial de suas vidas. Essa dicotomia dissonante deverá ser “quebrada”, os pré-conceitos que este traz no seu modo de ser, deverá ser excluído de sua existência para se conseguir algo de aproveitável para ele e o conjunto em formação. O relaxamento provocativo, de certos indivíduos alienados que não desejam assumir um trabalho decente, ás vezes; absorve uma massa simpatizante e se tornam até líderes em certas salas de aulas e frequentemente, levam outros a imitá-los, e a não se interessarem pela importância do que lhes é proposto, prejudicam colegas e professores e o andamento geral normal das aulas, criam dissonância entre professor – aluno.
Na nossa era pré-robotizada e de necessidades de indivíduos altamente qualificados profissionalmente, o que acontece em relação a isso é uma aberração discrepante em vários sentidos e além disso, cria-se um foco em ebulição anti-social dentro da comunidade em que participam. Os professores esperam que os alunos dedicados de boas famílias, os que trazem boa bagagem cultural, educados em famílias estruturadas, não sigam esses exemplos distorcidos. Provavelmente muitos dos alienados conseguirão seu diploma e sua formação, mas; então no decorrer do tempo, ao enfrentar um nível superior universitário ou uma profissão em que se exige intelectualidade e competência, encontrarão em si próprios dificuldades. Nós educadores sabemos muito bem discernir as espécies de problemas comportamentais dos nossos pupilos, assim como: a transição da idade, a modificação do seu próprio corpo, ou as demais dificuldades que cada um começa a enfrentar.
O que se propõe e se espera para cada estilo “de ser” em formação, é a relação da transformação da pedra bruta que sendo lapidada se transforma numa jóia de infinito valor. Cabe ao cliente ter consciência de necessidade da absorção dos valores por seu próprio interesse.
Na nossa era pré-robotizada e de necessidades de indivíduos altamente qualificados profissionalmente, o que acontece em relação a isso é uma aberração discrepante em vários sentidos e além disso, cria-se um foco em ebulição anti-social dentro da comunidade em que participam. Os professores esperam que os alunos dedicados de boas famílias, os que trazem boa bagagem cultural, educados em famílias estruturadas, não sigam esses exemplos distorcidos. Provavelmente muitos dos alienados conseguirão seu diploma e sua formação, mas; então no decorrer do tempo, ao enfrentar um nível superior universitário ou uma profissão em que se exige intelectualidade e competência, encontrarão em si próprios dificuldades. Nós educadores sabemos muito bem discernir as espécies de problemas comportamentais dos nossos pupilos, assim como: a transição da idade, a modificação do seu próprio corpo, ou as demais dificuldades que cada um começa a enfrentar.
O que se propõe e se espera para cada estilo “de ser” em formação, é a relação da transformação da pedra bruta que sendo lapidada se transforma numa jóia de infinito valor. Cabe ao cliente ter consciência de necessidade da absorção dos valores por seu próprio interesse.
Com tudo isso colocado em evidência e circunstâncias, cada cidadão poderá visualizar já, desse modo que haverá muito trabalho sem dúvida durante este ano, mas tudo isso levará em consideração a vida vivenciada do dia-a-dia, o ser humano, o respeito à liberdade individual, as transições das idades, os problemas externos e familiares, o trabalho e atividades extras escolares, as condições físicas de cada um etc.
O que proponho nesse “espaço-tempo” é um aprender brincando com a ciência, é um estudo que deverá ser considerado em importância máxima, de grau supremo, ou um estímulo para descobertas sem neuras. Os alunos deverão saber que para tudo isso tem um amigo na sala de aula, dando-lhes apoio, forças, entusiasmo e aplaudindo suas metas alcançadas. Felicidades para aqueles que estarão durante todo este ano juntos nesse oceano de luzes da razão e sabedoria. Provavelmente muitos de vocês brilharão.
Prof. Antonio - química
Antonio Spereta Rocha
1
A Definição da Pseudomonas aeruginosa
Habitat
2- O Habitat da Pseudomonas Aeruginosa
A Morfologia ou Estrutura da Pseudomonas Aeruginosa
Modelo simplificado de um plásmídio que
possui a forma de um anel.
O Efeito do Cloreto de CálcioEm
Infecção Experimental em Camundongos Com Pseudomonas
aeruginosa Aumento do Potencial de Colonização
Experiência feitas com
camundongos em que foram administrado solução de cloreto de cálcio misturada
com duas cepas diferentes de Pseudomonas
aeruginosa aumentou
a virulência dessas bactérias, isto foi comprovado quando se observou o
aumentou da virulência para algumas formas de pseudomonas. Foi usado uma
solução preparada a 50% da dose letal da solução de cloreto de sódio misturada
com Pseudomonas aeruginosa, fora aplicada por via intramuscular, subcutânea e intraperitonial. Nos
camundongos em que foram aplicados as formas de número 5 houve um decréscimo no
poder da infecção. Isto comprovou que a forma denominada de número 5 causou
menos infecção. A experiência foi feita por mais de 3 ordens e nos mesmos
locais de aplicação as formas de solução de mesma magnitude que não teve nenhum
motivo para ser considerável pois os efeitos não foram tão devastadores. Outra
solução preparada de 10.000 microrganismos da forma número 5 juntamente com a
forma N 10 misturada com cloreto de cálcio, ambas essas formas provocaram uma
virulência muito forte e se multiplicaram no local da injeção. A forma 5
subsequentemente observada causou infecção sistêmica enquanto a forma N 10 não
pode causar a mesma infecção. A virulência comprovadamente aumentou o efeito
com o cloreto de cálcio. Porém a mesma solução pode ser sucessivamente aplicada
em processos de ensaios em camundongos imunizados com a forma 5 modificada sem
causar infecção. (Yutaka et al.,1985)
Os Vários Fatores de Virulência das Pseudomonas
Pseudomonas
Pseudomonas aeruginosa,
Importância e
Diagnóstico
Clínico
Trabalho
apresentado para
conclusão de curso de pós
graduação: especialização em
microbiologia.
São Paulo 2006
Agradecimento à Deus
Agradeço
principalmente a Deus esse ser superior, essa grande idéia, essa intelingência inimaginável à nós simples seres humanos. Essa grande sabedoria
que criou todo universo e me deu a vida e me fez participante de um pedacinho
dele e poder ver tantas e tantas coisas neste flash de vida que é comum a todos
os seres humanos. Ele permitiu a todos explorar e aprender uns com os outros com mestres, com as pessoas
que me direcionaram durante não só durante esse período de estudo e trabalho, mas durante toda a minha vida, que foi e está sendo uma captação de tantas e
tantas formas de conhecimentos.
O contato com pessoas só ajudaram de uma forma ou de outra, até nas horas difíceis nas “broncas” do mestre, aprendemos na convivência e nos desenvolvemos na troca de conhecimentos na intelectualidade e espiritualmente
O contato com pessoas só ajudaram de uma forma ou de outra, até nas horas difíceis nas “broncas” do mestre, aprendemos na convivência e nos desenvolvemos na troca de conhecimentos na intelectualidade e espiritualmente
Resumo
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Desde o inicio quando comecei o trabalho em laboratório no setor de microbiologia em especial, de bacteriologia: houve um despertar da curiosidade e o desejo de aprofundar os conhecimentos mais e mais sobre esse assunto desses microrganismos de um modo geral. Sem dúvida que no início achei complicadíssimos e vastíssima essa área e também os métodos de diagnósticos laboratoriais, mas, alguém deu-me um empuxo e segui em frente aprendendo cada vez mais e mais sobre esses organismos patogênicos que causam tatos e tantos sérios problemas à saúde humana. O mais curioso de tudo é o que levou-me a escrever sobre a bactéria Pseudomonas, por incrível que pareça ela se distingue de outras bactérias visualmente através da coloração que provoca muito facilmente nas placas de ágar Mueller Hinton em que se faz a leitura e o diagnóstico da sensibilidade bacteriana aos antimicrobianos. Esses antibiogramas os quais eu pegava para fazer a leitura apresentava a coloração verde-amarelada, ás vezes somente verde, ou verde azulada nessas placas, isso a distinguia das outras espécies de bactérias das outras placas de leitura. Isso me chamou muito a atenção sobre essa espécie de bactéria. Um outro motivo também me chamou a atenção principalmente era quanto á resistência aos antibióticos. Haviam placas a serem lidas as quais a cepa era resistente a quase todos os antibióticos testados ás vezes apresentavam halo de sensibilidade muito pequeno e ás vezes o disco de antibiótico nem apresentava halo nenhum o que indicava a forte resistência ao antibiótico. De início achei que o aprendizado nos cursos superiores, os quais fiz, me deram base e suporte com passagem muito rápida e foram apenas suporte ou encaminhamento para um conhecimento muito mais aprofundado o qual eu mesmo teria de desempenhar sozinho. Eu desejava conhecer tudo sobre todas as espécies de bactérias, porém, não haveria tempo suficiente nem mesmo durante uma vida toda. Optei-me pelo gênero pseudomonas, queria saber tudo sobre ela, todos os detalhes e características dessa bactéria, a definição, o seu habitat natural e o habitat como patógeno oportunista, queria saber sobre a morfologia a estrutura das membranas da cápsula, da camada de slime, dos flagelos, dos ribossomos, da pili, das toxinas produzidas por ela, dos antígenos dos locais de ligação antígeno anticorpo, das patogenias que essa bactéria causa, e por fim do diagnóstico laboratorial, e dos medicamentos utilizados contra ela e os casos de prevenção das infecções causadas por esse tipo de microrganismo. É claro que me deparei com um assunto tão vasto o qual para se fazer um estudo completo apenas sobre esse microrganismo levaria muitos anos de pesquisa. Então o que passo a descrever sobre a Pseudomonas aeruginosa são apenas fragmentos de conhecimentos gerais os quais esforcei-me muito para realiza-los.
Sumário
2 O habitat da Pseudomonas
aeruginosa
3 A
Morfologia da pseudomonas
4 Os processos da Respiração de Pseudomonas aeruginosa
5 Os
processos de Germinação e Crescimento da Pseudomonas
aeruginosa
6
Fatores de Virulência de Pseudomonas
aeruginosa
7 As Patologias Causadas pela Pseudomonas aeruginosa
8 Diagnóstico laboratorial da Pseudomonas aeruginosa
9 Medicamentos
Utilizados Contra a Pseudomonas
aeruginosa
10 Bibliografia
A Definição da Bactéria Pseudomonas
A Definição da Bactéria Pseudomonas
Podemos definir as bactérias do gênero
pseudomonas de um modo geral como bacilos Gram-negativos aeróbios ou
facultativos. Dentro desse gênero há um número de aproximadamente 100 espécies,
das quais 25 podem estar relacionadas com o homem. São móveis com flagelos
polares e de localização própria para cada espécie (Trabulsi
et al., 1999). Pertencem a família
Pseudomonadaceae que são identificados baseado no tipo genômico de I rRNA.
Desse modo existem cinco grupos genômicos baseados na estrutura do RNA, todos
eles são pertencentes a essas famílias denominadas de: grupo I, grupo II, grupo
III, grupo IV, grupo V.
O gênero que pertence ao grupo I é o de maior interesse
clínico e de importância médica, no qual estão presentes as seguinte espécies
causadoras das patologias: Pseudomonas
aeruginosa, a Pseudomonas fluorescens, a Pseudomonas putida.
A
pseudomonas foi isolada pela primeira vez por Gessard, em 1882. (Koneman et al., 2001). Não são fermentadoras de
açúcares, mas são móveis e possuem um metabolismo diversificado, catalisando
carbono de diversas procedências, como do solo, de produtos alimentares, de
produtos farmacêuticos, de conservas. (Koneman et al.,
2001). As espécies desse grupo produzem pigmentação hidrossolúvel a
pioverdina e outros grupos a piocianina, que aparece como uma fluorescência branca ou
azul esverdeada sob luz ultravioleta de onda longa de 400 nm. Estudos
realizados demonstraram que essas pigmentações são estimuladas em meios com
alta concentração de fosfatos (Koneman et al., 2001).
A bactéria mais estudada do gênero Pseudomonadaceae é a Pseudomonas aeruginosa, a qual necessita de oxigênio para se desenvolver. Seus bacilos Gram-negativos se apresentam em grupos de cadeias curtas, ou então; esses bacilos aparecem simplesmente isolados ou ainda em grupamento sobrepostos um aos outros formando uma massa compacta cobrindo toda a lâmina, quando vista ao microscópio óptico em aumento de 1100 x. Em placa com do ágar quando é cultivada em laboratório especialmente no agar sangue, suas colônias crescem de forma irregulares e espalhadas mais ou menos incolores, esse crescimento muitas vezes pode suplantar outra espécie de bactéria que cresce juntamente com ela, ou pode ocorrer uma mistura que não é possível distinguir uma da outra através da microscopia óptica com coloração gram, tornando desse modo difícil a identificação de cada espécie diferente e além disso para separar por repicagem em meios específicos essas duas espécies que crescem juntas também se torna um trabalho árduo para o próprio técnico experiente. O seu corpo celular possui um flagelo polar, no entanto não raramente pode aparecer formas com dois ou três flagelos. Essas bactérias são móveis, mas não são esporuladas. (Lopez et al., 2002).
A bactéria mais estudada do gênero Pseudomonadaceae é a Pseudomonas aeruginosa, a qual necessita de oxigênio para se desenvolver. Seus bacilos Gram-negativos se apresentam em grupos de cadeias curtas, ou então; esses bacilos aparecem simplesmente isolados ou ainda em grupamento sobrepostos um aos outros formando uma massa compacta cobrindo toda a lâmina, quando vista ao microscópio óptico em aumento de 1100 x. Em placa com do ágar quando é cultivada em laboratório especialmente no agar sangue, suas colônias crescem de forma irregulares e espalhadas mais ou menos incolores, esse crescimento muitas vezes pode suplantar outra espécie de bactéria que cresce juntamente com ela, ou pode ocorrer uma mistura que não é possível distinguir uma da outra através da microscopia óptica com coloração gram, tornando desse modo difícil a identificação de cada espécie diferente e além disso para separar por repicagem em meios específicos essas duas espécies que crescem juntas também se torna um trabalho árduo para o próprio técnico experiente. O seu corpo celular possui um flagelo polar, no entanto não raramente pode aparecer formas com dois ou três flagelos. Essas bactérias são móveis, mas não são esporuladas. (Lopez et al., 2002).
Habitat
2- O Habitat da Pseudomonas Aeruginosa
A Pseudomonas
aeruginosa pode ser encontrada naturalmente no solo, na água na
superfície de plantas, na pele de animais e também na superfície da pele nos
humanos. (Todar et al) É um germe oportunista
assim como outras espécies do gênero pseudomonas elas podem habitar as fossas
nasais em pacientes que recebem medicamentos betalactâmicos, pois estes
medicamentos costumam reduzir a população da microbiota normal local, possibilitando a colonização por outras espécies inclusive a nossa referida
bactéria (Trabulsi et al., 1999). A Pseudomonas
aeruginosa também pode ser encontrada em água potável, ela ataca
o material dos recipientes plásticos como o cloreto de polivinila e além disso; pesquisas
laboratoriais comprovaram que ela pode sobreviver por semanas e até proliferar
em água praticamente pura ou em água destilada. (Boyd
1995).
P.
aeruginosa em vegetais
A
origem natural da bactéria que predispõe a uma infecção pode ser o solo. Do
solo o agente infeccioso pode ir passando para produtos comestíveis e daí para
objetos, desses, a transmissão chega ao contato pessoal humano que serve de
vetor e deste ser transmitido pelas mãos, por pias de cozinha, por soluções preparadas e
cremes aplicados ao paciente, pela inalação de partículas do ar ou através
de instrumentos cirúrgicos. (Sylvia et al., 1974)
As descobertas direcionadas sugeriam que vegetais cortados ou saladas na
cozinha, essas comidas poderiam ser veículos primários de transmissão de
bactérias como a E. coli, a Klebsiella e Pseudomonas. Estava bem evidente que
os pacientes poderiam adquirir essas bactérias para a sua flora intestinal ao
consumir esses alimentos. (Sylvia et al., 1974).
Kominos et al; pesquisando em vegetais cru manipulados
na cozinha do hospital onde trabalhavam encontraram a P.aeruginosa e sugeriu
que estes seriam os veiculadores de doenças bacterianas naquele recinto. A
partir daí, deu-se relevância ao fato de que os vegetais e legumes em condições
favoráveis poderiam abrigar colônias de microrganismos patogênicos. Indo mais
adiante através de suas pesquisas concluiu que alimentos viriam a ser um reservatório
natural de bactérias, suprimiu a dieta a base de legumes e verduras frescas “in
natura” durante seu trabalho, observou que houve certo controle da infecção dos
pacientes. Suas pesquisas levaram a acreditar que o mesmo se daria com as
plantas ornamentais que também seriam mais um dos fatores veiculadores de
muitas infecções inclusive por Pseudomonas. (Sylvia et
al., 1974)
P. aeruginosa no solo
Para comprovar que os solos também são reservatórios
de bactérias e daí é passado para as plantas, experiências foram feitas nos EUA
em laboratório utilizando amostras de várias localidades do Estado da
Califórnia, com 50 gramas
de solo arenoso com um pH que variava entre 7,0 e 7,3 também era imprescindível
que as amostras a serem determinadas estivessem livres da bactéria Pseudomonas;
tomou-se o cuidado de que a água também e o fertilizante usado que foi o
inorgânico estivesse livre de qualquer contaminação. Dois tipos ou lotes de
amostras de solos foram semeadas de modos diferentes um tipo com a bactéria
Pseudomonas e outras amostras de solos livres de bactérias Pseudomonas e outras
amostras foram usadas como controle sem serem inoculadas com Pseudomonas. O
passo seguinte da experiência consistiu em semear as amostras de hortaliças que
produziam frutos, como o tomate, além de ser plantadas espécies em que se
usavam as folhas na alimentação como o alface, aipo, outras verduras de talo
foram colocadas no experimento como a couve-flor e o espinafre. (Sylvia et
al., 1974)
As
amostras dos experimentos permaneceram em câmaras a vácuo e em diferentes
condições experimentais, mantidas em câmara totalmente isolada. Plantas como
alface e o feijão foram semeadas no solo em que haviam sido inoculadas cepas de
Pseudomonas para ver se ao se desenvolverem neste solo preparado em
laboratório, a bactéria também se multiplicaria nessas plantas, contaminando
desse modo os vegetais.
Convém ressaltar que as amostras de solos
que não foram usadas nos testes de plantio de vegetais; cada uma dessas
amostras foi diluída em água destilada depois de centrifugada foi semeada em
caldo de acetamida e sais nutrientes e incubado por 48 horas. Do mesmo modo o
experimento também foi feito com a coleta de amostras de plantas de localidades
diferentes do Estado e de lugares aleatórias com o total de 25 espécies de
plantas de cada localidade e feitas as análises laboratoriais. Foram também
preparadas amostras para incubação para possibilitar a observação de
crescimento de colônias bem visíveis, logo após; decorrido esse tempo de
preparação o caldo foi semeado em placas de Petri com o meio de King e
citremide e incubado a 42ºC em câmara de vácuo. (Sylvia
et al., 1974)
O resultado que comprovaria se o solo contaminado
poderia ou não atuar como reservatório natural desta bactéria e que por
consequência contaminaria as verduras, que por sua vez contaminariam os seres
humanos. Através destas pesquisas revelaram que a bactéria Pseudomonas aeruginosa cresceu
em 14 amostras de 58 testadas com solo da Califórnia, e que várias amostras de
vegetais que também tinham sido analisadas apresentaram crescimento da bactéria
Pseudomonas. Outras pesquisas feitas por Ringem e Drake demonstram que de 100
amostras de solos, somente três apresentaram crescimento positivo para as
Pseudomonas. Um outro fator importante observado durante as análises
laboratoriais foi que a Pseudomonas nas verduras apresentaram a produção
pigmento piocianina, que é uma das características das bactérias patogênicas
nas doenças hospitalares.
Portanto; conclui-se que o solo é
reservatório natural de bactérias e estas podem estar localizadas em terrenos
como em espécies de pacotes, ou em localizações específicas que possibilitaria
sua existência de um foco local, ou que haja condições favoráveis de
crescimento para elas como comida, temperatura, umidade, etc. (Sylvia et al., 1974)
Também
outro fato importante que coube a pesquisa era o de comprovar se o solo e os
vegetais se contaminariam durante a colheita ou durante o processo de consumo.
Kominos realmente comprovou que vegetais frescos carregam formas de
Pseudomonas, porém ainda ficou um espaço em duvida que seria se a contaminação
poderia ocorrer durante a colheita, ou mesmo durante a manipulação pelos
humanos, nos processos de transito dessa mercadoria até o consumidor, ou mesmo
com outras espécies de contato durante esse trajeto. Que poderiam ser contatos
com solos diferentes, com insetos, ou com várias pessoas humanas. Haveria ainda
outros modos de contaminação de solos cultiváveis que seriam: mudanças de
práticas agrícolas ou práticas de fertilização diferente desse solo. Na
conclusão do seu trabalho ficou claro que os microrganismos não se encontram
disseminados por toda a extensão dos solos cultivados, mas em pacotes nesse
solo, contanto que haja alimento disponível. (Sylvia et
al., 1974)
A Morfologia ou Estrutura da Pseudomonas Aeruginosa
Estrutura da Pseudomonas
aeruginosa
Alguns autores descrevem a
morfologia do bacilo da Pseudomonas
segundo seu critério de visualização, Iglowisk descreve a bactéria como
sendo bastonetes curtos Gram-negativos medindo de 0,4 a 2,0 micrômetros de
comprimento, enquanto que Todar et al., 2004,
descreve como sendo sendo bacilos Gram-negativos medindo de 0,5 a 0,8 por 1,5 a 3,0 micrômetros de
comprimento, Boyd 1995, descreve como um bacilo
de 2 a 4 micrômetros de comprimento, e a maioria
das formas são móveis, com motilidade impulsionada por um único flagelo polar,
sendo que alguns desses microrganismos possui alta capacidade de deslizamento o
que facilita a sua locomoção de um lado para outro. Na maioria das vezes esses
microrganismos produzem uma camada de slimy que dá a colônia a capacidade de
crescer e multiplicar aderindo às superfícies e formar um biofilme. Outra
descrição é da morfologia característica de bacilos retos ou ligeiramente
curvos, com a motilidade impulsionada por um ou mais flagelos polares descrito
por Koneman et al., 2001.
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Esquema
simplificado da Pseudomonas aeruginosa apresentando flagelos e pili.
Fig. 1 Esquema representativo da bactéria Pseudomonas aeruginosa medindo de 0,5 a 0,8 de largura por 1,5 a 3,0 μm de comprimento a
sua motilidade se dá por um único flagelo polar, porém algumas formas possuem
dois ou três flagelos. (Iglewski et al., 2001)
Com freqüência é isolado um morfotipo não mucóide de secreções respiratórias de
pacientes com fibrose cística e infecção crônica por P.
aeruginosa. (koneman et al., 2001).
Cápsula a
Camada Mais externa de Revestimento Da Pseudomonas aeruginosa
A cápsula dá a forma de um halo envolvendo
a bactéria é a camada da parede externa da bactéria a qual é separada por um
fino periplasma que é um espaço entre uma membrana e outra é o maior fator de
virulência das bactérias que as possuem, como é o caso da Pseudomonas
aeruginosa . Ela pode ser tão importante que pode facilitar a
fuga da bactéria da fagocitose pelos macrófagos devido a sua forma estrutural
deslizante que promove capacidade de fugir do macrófago. A cápsula está
intimamente associada a camada de slime (Boyd et al.,
1995). A fosfatase fosforilcolina (PChP) é uma molécula secretada pela vesícula
seminal de animais superiores e possui o peso molecular de 184.151 u.m.a. Nos
seres unicelulares ela também existe, e é uma enzima especialmente
periplasmática, na bactéria P.aeruginosa é produzida
simultaneamente com outra enzima denominada de
fosfatase hemolítica C (PLc-H) geralmente na fase de crescimento da
bactéria que utiliza na síntese da fosfatase fosforilcolina a betaína, a colina, dimetilcolina ou a
carnitina. É um dos componentes estimuladores da formação da cápsula da
P. aeruginosa especialmente para a forma mucóide dessa bactéria. Essa
cápsula é formada de alginato que pode ser definido como uma espécie de goma
viscosa que é abundante nas paredes de uma variedade de células especialmente
aparece muito em algas marrons. É um copolímero linear “montado” por blocos de
homopolímeros com ligação beta entre esses blocos β-1,4-D-manurato (M) e o
epímero dessa ligação ocorre no carbono 5 do alfa–gluconato (G)
respectivamente. Essas ligações que juntam a seqüência dos diferentes blocos.
Há vários tipos de blocos de resíduos como o bloco de resíduos G, M, MG etc.
Por isso existe uma variedade de tipos diferentes de alginatos, os quais podem
ser utilizados nas indústrias têxteis, cosmética ou em produtos que sofrem
desidratação porque o alginato absorve água instantaneamente, na pseudomonas
forma o biofilme que protege a bactéria. O alginato ou ácido algínico
juntamente com um lipopolisssacarídio, forma essa camada mucóide que envolve o
microrganismo. E além disso; através de estudos observou-se que essa forma de bactéria
a pseudomonas também elabora proteases e fosfolipase C extracelularmente.(Krieg et al ., 1988)
Membranas Da Pseudomonas
aeruginosa
O Antígeno–O Na Parede da Pseudomonas
aeruginosa
O antígeno-O é um componente da parede celular
bacteriana é somático e também chamado o composto específico do
lipolissacarídio (LPS) o qual é uma molécula de lipídio ligado ao
polissacarídio. É o maior componente da parede celular das bactérias Gram-negativas,
são os lipopolissacarídios que formam as endotoxinas que se comportam como
importantes antígenos das bactérias contra o próprio hospedeiro denominado de
antígeno-O. No sentido exato da palavra o lipolissacarídio é o produtor de
anticorpos que agem contra o próprio hospedeiro. Quando a bactéria ataca um
paciente, este possui mecanismos de reconhecimento desse antígeno para a
produção dos anticorpos contra esse antígeno. Esse antígeno que é formado por
polissacarídios não possuem nenhum tipo de gosto são polímeros formados por
muitos monossacarídios que são ligados através de ligações glicosídicas
formando essas moléculas grandes amorfas insolúveis em água. Essa molélula se
junta ao lipídio e forma o polímero o lipopolissacarídio então, quando estão
ligados um ao outro estão formando os LPS. Esse lipolissacarídio como já foi
dito é o maior componente da parede celular das bactérias gram-negativas.
Penetrando no interior do organismo do hospedeiro, transforma-se no que é um
potente fator endotóxico. Esse antígeno-O, é portanto; um importante antígeno
contra seu próprio hospedeiro.
A patogenia da bactéria em questão tem a
capacidade de elaborar variados compostos que atuam externamente ao corpo
bacteriano esses produtos variados bacterianos associados são capazes de vencer
barreiras de defesas e provocar a colonização e estabelecimento da infecção no
hospedeiro atacado. Um dos principais compostos elaborado pela bactéria é o LPS
ou lipolissacarídio como já foi dito, fica na superfície externa da bactéria
ele é muito conhecido por seu desempenho no papel de proteção contra os
mediadores dos soros dos pacientes, esses soros podem possuir propriedades
endotóxicas para a bactéria e são capazes de provocar a sua lise. O LPS possui
uma porção a qual é a mais heterogênea e que é denominado de antígeno-O. O
lipolipolissacarídio possui o antígeno tipo O que está presente numa
determinada região específica dessa molécula, e esse antígeno é o que confere a
resistência aos organismos de defesa presentes no soro do hospedeiro. (Rocchetta
et all., 1999).
Os Dois Tipos De LPS Lipopolissacarídios Produzidos
Pela Pseudomonas aeruginosa
A Pseudomonas
aeruginosa é capaz de sintetizar concomitantemente dois tipos de LPS
(lipopolissacarídio) reconhecidos como antígenos potenciais. Eles são
conhecidos como LPS de banda A e LPS de banda B. O LPS de banda A contém uma
região onde está contido o antígeno-O um polissacarídio composto pelo
homopolímero D-ramnose. Enquanto que o LPS de banda B que possui o antígeno
tipo O é um heteropolímero de estrutura que varia entre um número razoável de
20 diferentes sorotipos tipo O da P.
aeruginosa.
Os genes que são os codificadores para as
enzimas que direcionam a síntese das duas bandas de LPS do antígeno"O" estão
organizados dentro de dois locais separados e situados em diferentes
localizações do cromossomo responsável pela sua montagem. Na revisão
bibliográfica e experimental que os pesquisadores em questão fizeram, eles
resumiram os dados da seguinte forma: confirmando suas pesquisas concluíram que
esses dois locais de produção deveriam ser classificados como locais de
produção de LPS de banda A e LPS de banda B. Esses antígenos são sintetizados e
agregados, numa unidade, construída especialmente por enzimas dedicadas com a
especificidade para essa determinada função.Um fato importante observado foi o
exemplo de uma única proteína ser requerida para a síntese da banda A, foi
também requerida para a síntese da banda B as responsáveis pela síntese do
antígeno O, ou seja; para a síntese de ambos os LPS, essa molécula requerida
para a síntese de ambos os LPS foi o alginato que ainda é questionado pelos
pesquisadores que não chegaram a uma conclusão razoável. Nas recentes pesquisas
mantiveram a tradição sobre a identificação dos genes do genoma da Pseudomonas aeruginosa
responsável pela síntese da banda A e banda B são homólogos e o local de
aglomeração e “sítio” desses genes que são capazes de influenciar a síntese do
antígeno-O, as pesquisas levaram a conclusão que somente a Pseudomonas
aeruginosa é a que representa um único modelo de sistema que permite os estudos
dos heteropolímeros e dos homopolímeros para a síntese desse antígeno-O. Foi a
única bactéria que permitiu a execução de um exame de interrelacionamento para
a síntese da molécula do LPS e de outros determinantes da virulência
bacteriana. (Rocchetta et all., 1999).
Determinação do Número de Proteínas Envolvidas na
Membrana Externa da Pseudomona aeruginosa Através da Eletroforese
em Gel de Sodium Dodecyl Sulfato de Poliacrilamida
Como sabemos a membrana da P. aeruginosa
é formada por três camadas, nelas estão contidas várias estruturas. Foram
feitos estudos sobre as proteínas que compõem as camadas da membrana e em
particular os estudos, foram dirigidos mais à parte que mais nos toca de
imediato sobre esse assunto que foi especialmente a parte da camada mais
externa da membrana desse microrganismo. Utilizando eletroforese através do gel
sodium dodecyl sulfato de poliacrilamida, o qual é um composto muito utilizado
na técnica de eletroforese em bioquímica, na genética, e na biologia molecular.
Esse composto é utilizado para desmembrar as proteínas sem alterar a sua
estrutura molecular, e sem alterar suas qualidades próprias e sem as
modificações e outros fatores que possam acontecer e interferir na análise a
ser feita. O procedimento da técnica permitiu a ocorrência da separação das proteínas de acordo com a sua
mobilização através da função eletroforética de deslocamento de cada proteína
através desse gel dependendo é claro do tipo de cada proteína a ser separada,
como o comprimento da cadeia molecular do polipeptídio, do seu peso , e das
altas concentrações dessas proteínas localizadas no local da análise da
amostragem. Através desse método ficou demonstrado que a membrana mais externa
da Pseudomonas aeruginosa a qual fora separada e aquecida, e a
temperatura provocou uma solubilização dessas proteínas o que causou uma
modificação na sua capacidade de mobilização ou deslocamento através da
eletroforese por esse gel sódio dodecyl sulfato de poliacrilamida. A partir da
análise dos deslocamento de cada uma dessas
proteínas comprovou-se a existência de cerca de oito tipos diferentes de
proteínas de alto porte nessa camada da membrana. Quatro dessas proteínas
modificadas pela exposição à temperatura tinham características moleculares
similares ás proteínas da membrana externa Escherichia coli. (Hancock et all., 1979).
A Proteína F da Pseudomonas
aeruginosa Necessita de Maior Temperatura Para Solubilizar-se e Diminuir
seu Deslocamento Através da Técnica de Eletroforese. O Uso do 2-Mercaptoetanol
Outro fato importante observado foi um tipo
de proteína diferente das outras que não mudava o seu deslocamento durante a
análise por eletroforese.
Quando foi adicionado um lipolissacarídio para a solubilização dessa proteína, isto causou uma reversibilidade do padrão de aquecimento que se tornou modificado. A temperatura também modificou os poros de difusão das proteínas em geral através desse gel sulfato de sódio dodecyl poliacrilamida e a proteína em questão denominada de proteína do tipo F que costumeiramente era estável para o deslocamento nesse gel utilizado na mesma temperatura padrão para solubilização protéica das proteínas em geral, essa proteína F permanecia estável em sua difusão através do gel usado na eletroforese mesmo após longos períodos de aumento da temperatura. Adicionou-se então o 2-mercapentanol que juntando com o aumento da temperatura, de ebulição e fervura para solubilização proteica para difusão delas no sulfado de sódio dodecyl poliacrilamida foi assim possível ocorrer uma modificação nesse deslocamento dessa proteína através dos poros pelo aquecimento para a ocorrência da modificação do resultado da eletroforese.
O 2-mercaptoetanol desnatura a proteína pela quebra das ligações das proteínas nos ligamentos das pontes dissulfídricas, quebrando assim a estrutura quaternária das proteínas que são as subunidades oligoméricas. O 2-mercptoetanol também age invadindo as estruturas de algumas formas de proteínas terciárias quebrando-as em suas unidades de ligações.
Quando foi adicionado um lipolissacarídio para a solubilização dessa proteína, isto causou uma reversibilidade do padrão de aquecimento que se tornou modificado. A temperatura também modificou os poros de difusão das proteínas em geral através desse gel sulfato de sódio dodecyl poliacrilamida e a proteína em questão denominada de proteína do tipo F que costumeiramente era estável para o deslocamento nesse gel utilizado na mesma temperatura padrão para solubilização protéica das proteínas em geral, essa proteína F permanecia estável em sua difusão através do gel usado na eletroforese mesmo após longos períodos de aumento da temperatura. Adicionou-se então o 2-mercapentanol que juntando com o aumento da temperatura, de ebulição e fervura para solubilização proteica para difusão delas no sulfado de sódio dodecyl poliacrilamida foi assim possível ocorrer uma modificação nesse deslocamento dessa proteína através dos poros pelo aquecimento para a ocorrência da modificação do resultado da eletroforese.
O 2-mercaptoetanol desnatura a proteína pela quebra das ligações das proteínas nos ligamentos das pontes dissulfídricas, quebrando assim a estrutura quaternária das proteínas que são as subunidades oligoméricas. O 2-mercptoetanol também age invadindo as estruturas de algumas formas de proteínas terciárias quebrando-as em suas unidades de ligações.
A segunda fase experimental da realização
da pesquisa foi constatar que a membrana externa da Pseudomonas
aeruginosa que possui a proteína F, essa proteína só se solubiliza
associada com lipolissacarídio purificado com aumento da temperatura que não
causou efeito na sua solubilidade da proteína e que necessitou da adição do
2-mercaptoetanol que associado a alta temperatura solubilizou-se para que
pudesse ocorrer a sua difusão através dos poros do gel sulfato de sódio dodecyl
poliacrilamida, ou seja por essa técnica de diagnóstico por eletroforese
ocorresse.
Concluindo a proteína F representa uma nova
classe de proteína que mesmo aquecida só pode ser solubilizada com a presença
do 2-mercaptoetanol o qual modificou a mobilização dessa proteína através do
gel, independentemente de outros tipos de proteínas. No entanto as con dições
de otimização para um exato conhecimento das proteínas da membrana externa da Pseudomonas
aeruginosa pela eletroforese com o sulfato de sódio dodecyl
poliacrilamida são ainda muitos motivos de discussão científica.(Hancock et all.,
1979).
A Membrana
Citoplasmática Da pseudomonas e As Inclusões
Estudos detalhados das três camadas da
membrana da Pseudomonas aeruginosa revelaram
que esse microrganismo possui muitas estruturas funcionais
localizadas nesse local que até então não estavam ainda
completamente elucidadas com relação a sua estrutura e funcionalidade. Inclusões
foram encontradas na membrana citoplasmática de células P. aeruginosa que foram cuidadosamente secionadas e duplamente
preparadas e tratadas com o fixador ácido
N-2-Hidroxietilpiperazina-N-etanosulfônico estes
trabalhos revelaram que o número dessas inclusões nessas camadas membranosas,
variava em tamanho e morfologia. (Lee et al., 1971). As observações foram feitas através da microscopia eletrônica de
varredura por feixes de elétrons que revelaram
formas as quais antes eram invisíveis ou transparentes ao observador, puderam
desse modo ser agora observadas rotineiramente, além de detalhes que nunca
foram vistos antes puderam ser analisados, porque até então essas estruturas
pareciam estarem ligadas ou incorporadas uma as outras formando simplesmente o
conglomerado da membrana citoplasmática.
O tamanho das inclusões de membrana também foi medido e variaram de 120 a
300 nanômetros de diâmetro. (Lee et al., 1971). Quanto
á forma dessas inclusões, também foram observadas que possuíam uma certa irregularidade, enquanto que
a forma de outras estruturas que apareceram apresentavam um formato tubular que se situavam
especialmente na membrana citoplasmática.
Fazendo Parte das Três Camadas Espessas a Camada a
Mais Interna Apresenta Inclusões Denominadas Mesossomais
Em raras ocasiões entre as multicamadas
que consistem das três camadas que se apresentam espessas, há um amplo e
incomum número dessas inclusões que
também aí foram encontradas. Somando a tudo isso, os estudos detectaram duas
pequenas estruturas distintamente conhecidas como mesossomais estas, foram
minuciosamente estudadas nessas células e estas estruturas estavam situadas bem perto ou na
próximidade da membrana citoplasmática
bacteriana. Durante as observações um outro
tipo estrutural apareceu e levou-se a acreditar ser mais uma simples e fina estrutura
membranosa que apareceu, revelando mais um outro tipo de estrutura delicada
quase imperceptivelmente ligada às outras que consiste em fazer parte da
multicamada da membrana desse microrganismo.
Nas bactérias Gram-positivas é mais comum
do que nas Gram-negativas a formação de inclusões ao longo da membrana
citoplasmática. Mais recentemente estudos sobre a membrana citoplasmática
desses microrganismos observados rotineiramente revelaram essas formações em um
número muito grande de espécies bacterianas que atualmente são identificados
como mesossomos, ou ainda como partículas inclusas de polihidroxibutirato
(PAB). Estas últimas, ou seja; a PAB aparecem armazenadas nos vacúolos ativos
da superfície do corpo bacteriano. No entanto
estudando as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, as Gram-positivas
demonstram através de estudos que os mesossomos estão associados com as
formações transversais da parede celular durante a sua divisão nuclear. Citam
os pesquisadores trabalhando com os mesossomos de microrganismos Gram-negativos
que estas estruturas são particularmente raras e além disso, a maioria desses
microrganismos parecem não ter desenvolvido muito bem essas estruturas
mesossomais e diferem ainda na aparência daqueles observados nos microrganismos
Gram-positivos. Ponte et al., recentemente
registrou duas formas de mosossomos em Escherichia coli os quais são
vistos ligados à membrana citoplasmática. Ele também
afirma que essas inclusões podem desempenhar um papel importante na divisão
nuclear da célula. Ultimamente ele e seus colaboradores em observações
citológicas feitas em seu laboratório descobriram que havia a presença incomum
de várias formas de inclusões na membrana da Pseudomonas
aeruginosa, juntamente com outras
estruturas intracelulares mais tipicamente parecidas com inclusões mesossomais.
Para analisar essas inclusões com segurança ele utilizou técnicas especiais
necessárias à sua demonstração e comprovação.
Esquema da bactéria Pseudomonas
aeruginosa com suas inclusões mesossomais e estruturas intracelular
Esquema de montagem,
característica morfológica
e desenho de Antonio Sp Rocha.
Flagelos
O Flagelo da Pseudomonas aeruginosa e
o Fator Modulador da sua Síntese.
Foram observados em muitos casos a
estrutura morfológica de Pseudomonas, especialmente
em pacientes com fibrose cística pulmonar que
tinham a forma mucóide de infecção, ou seja, daqueles
microrganismos que produziam a camada de slimy ou alginato, mas apresentavam a
falta de flagelos. Esta hipótese foi levantada que poderia haver um regulador
que seria o alginato o inibidor da expressão do gene responsável pela formação
do flagelo da bactéria. Estudos feitos revelaram mutações no alginato tipo B,
alginato tipo R e alginato tipo T que resultaram em derivados incomuns, ainda
que mutantes com alginato tipo T que podem apresentar flagelos. O alginato tipo
T-dependente que controla a síntese de flagelo ocorreu através da inibição do
FliC (gene C da flagelina) mas não rpoN de transcrição (Garret et al.1999).
Ribossomos
Os ribossomos foram vistos pela primeira
vez nos meados da década dos anos 50 pelo biologista George Palado através da microscopia eletrônica eles
apareciam como grânulos ou partículas
densas. Em muitas bactérias estão espalhados pelo seu citoplasma são organelas
presentes no interior da célula, são as responsáveis pela organização dos aminoácidos em proteínas. Os
ribossomos na sua conformação estrutural são compostos de RNA e de proteínas
essas proteínas que o constituem são também chamadas de ribonucleoproteínas ou
RPM. Elas traduzem a memsagem que o RNA mensageiro mRNA traz e insere na
cadeia polipeptídica em geral; essa
cadeia polipeptídica já é uma proteína sintetizada. Podemos ainda dizer, que os
ribossomos sãos locais onde o DNA codifica a formação da união dos aminoácidos
para formar proteínas ( Internet 2007). São partículas citoplasmáticas responsáveis
pela síntese protéica composto de RNA 60% e proteína 40% .Eles podem ser
imaginados como fábricas produtoras de proteínas através de um complexo de
instruções genéticas provindo do cromossomo. Há uma outra curiosidade com relação
aos ribossomos é que eles podem se deslocar livremente através do fluido do
citoplasma da célula, ou então eles podem se ligar ao retículo endoplasmático
ou envoltório nuclear. Desde a descoberta dos ribossomos eles são conhecidos
como ribozimas, isto é levado a acreditar que eles podem ser restos do “mundo”
do DNA que foram separados que se especializaram em promover sínteses de
proteínas.( Internet 2007) Nos compostos
procariótas como é o caso das bactérias o coeficiente de sedimentação é 70 S e
são compostos de duas subunidades 30S e 50S. A biossíntese nas células
eucariotas são diferentes das células procariótas nos ribossomos mas possuem funções idênticas. (Trabulsi et al., 1999)
A Montagens das Proteínas no Ribossomo
Os antibióticos atuam a nível dos
ribossomos, uma síntese protéica que começa com a formação de um complexo de
iniciação constituindo por mRNA mensageiro
(mRNA) a qual é a fração 30 S do ribossomo chamado de formil-metionil
tRNA (met t-RNA) esta fração acopla a fração 30S com a fração 50S formando o
ribossomo 70S. Nos ribossomos 70S. (Trabulsi et al.,
1999). Os dois Existem
dois genes existentes são denominados de denominados de MexXY, são similares, e
reconhecidos como mexAB e o mexEF esses
dois genes são os mediadores das resistências às drogas , isto foi feito
experimentalmente e comprovado através da clonagem de parte do cromossomo da Pseudomonas
aeruginosa que confirmou a
existência desses dois genes de proteção ribossomal e por conseqüência da
resistência da pseudomonas. Estes genes se unem ao sítio A ou a subunidade 30S
do ribossomo impedindo como se fosse uma bomba de efluxo a entrada de
substâncias que como as tetraciclinas e outros múltiplos fármacos agindo
impedindo e protegendo da ação desses múltiplos fármacos.(Marcovits et al., 1985) Há 2 sítios n na subnidade 50S denominados sitio doador e sítio receptor.(Trabulsi et Al., 1999). Na formação deste
ribossomo, o códon número 1 do mRNA acoplado ao met-tRNA localiza-se no
sítio do doador e o número 2 no sítio do
receptor que está livre, em seguida o t RNA- transportando um aminoácido
específico que reconhece o seu códon número 2 ocupando o sítio do receptor. A
seguir a peptidil-transferase transfere o formil metionil para o aminoácido
ligado ao t RNA que ocupa o sítio do receptor o tRNA livre do formil metionil
sai do ribossomo deixando-o desocupado o sítio do doador. A seguir o mRNA se
desloca no ribossoma (translocação) levando o códon no ribossomo (translocação)
levando o códon número 2, ligando ao tRNA com 2 aminoácidos, para o sítio do
receptor número 3. Este códon será então reconhecido por um terceiro tRNA,
trazendo um aminoácido específico. O processo se repete até que entre no
ribossomo o códon de terminação da cadeia peptídica.
A
Atividade Dos Antibióticos No Ribossomo
Os medicamentos que atuam ao nível do
ribossoma são os aminoglicosídeos, as tetraciclinas, cloranfenicol,
eritromicina, lincomicina clindamicina. Os aminoglicosídeos tetraciclinas e
cloranfenicol, eritromicna, lincomicina e clindamicinae os aminoglicosídeos e
as tetraciclinas se fixam a subunidade 30S e os outros aminoácidos a
subunidades 50S. Ao se fixarem inibem a síntese protéica por diferentes
mecanismos. Ao aminoglicosídeos provocam vários tipos de alterações sendo a mais
importante a formação de ribossomos não funcionais. A estreptomicina se fixa
apenas a uma proteína da fração 30S do ribossomo, enquanto que a canamicina
gentamicina e provavelmente as demais fixam-se a várias proteínas. Esta
característica se explica a elevada taxa de mutação para a resistência à
estreptomicina. Os aminoglicosídeos são antibióticos bactericidas. As
tetraciclinas bloqueiam a síntese protéica porque quando fixada á unidade 30S
impedem a fixação dos RNA transportadores (t-RNA) ao ribossomo. Desta maneira
não ocorre a incorporação de novos aminoácidos e a cadeia peptídica não se
forma.
O cloranfenicol, lincomicina e a
clindamicina apresentam o mesmo mecanismo de ação, que seria impedir a união
dos aminoácidos pela inibição da peptidiltransferase. A eritromicina bloqueia a
síntese protéica porque quando fixada a unidade 50S, impede os movimentos de
translocação (Trabulsi et al., 1999)
Parede celular
Cápsula
Nucleóides
Inclusões intracelular
A Pseudomonas aeruginosa produz
um pigmento azul esverdeado que é característica dela a
qual é denominado de piocianina (Trabulsi et al
1999). A mesma descrição da coloração é feita por Boyd., 1995, que descreve algumas
formas de pseudomonas produzindo um pigmento amarelado fluorescente e solúvel em água,
porém somente a P. aeruginosa produz o
pigmento não fluorescente mas solúvel em água denominado piocianina, no
entanto; o mesmo autor descreve certas formas da mesma bactéria produzindo
piocianina e pioverdina ao mesmo tempo, que dá coloração esverdeada ao meio de
cultura.
Cromossomo
Os Plasmídios
Os plasmídios são estruturas circulares,
são moléculas autônomas e que se replicam por si mesmo sem a interferência
direta do DNA Os plasmídios existem na célula como se fosse um genoma
extracromossomal, é uma molécula que carrega somente uns poucos genes. O número
de plasmídios em uma célula de uma espécie de microrganismo é geralmente
constante de geração para geração. Embora, alguns plasmídios possam ser inseridos
no cromossomo bacteriano onde eles passam a fazer parte do genoma bacteriano.
Para a ciência isso vem a ser uma grande funcionalidade especialmente para a
ciência molecular. Os plasmídios são fáceis de serem manipulados e usados de
bactérias e a lise alcalina é o método de escolha para o isolamento do DNA
circular, ou ainda do RNA, de células bacterianas ela é uma técnica de
confiança, portanto; a mais usada porque é rápida e proporciona uma pureza do
DNA obtido das células. A lise alcalina depende unicamente da propriedade do
plasmídio do DNA. Ele é capaz de desnaturar rapidamente o anel e isto permite
que o plásmídio seja separado do cromossomo bacteriano, isto é; quando ele
estiver integrado a esse cromossomo. Os Plasmídios, eles podem ser integrados
ao genoma de mamíferos e portanto conferir às células desses mamíferos uma
funcionalidade genética ao qual esses plasmídios carregam. Assim eles dão a
você a habilidade de introduzir genes dentro de organismos usando genes de
bactérias que amplificam os genes dos mamíferos tornando-os híbridos esses
genes que são ”produzidos in vitro”. Esta minúscula, mas poderosa molécula de
plasmídio é á base da tecnologia do DNA recombinante. (Alcano
et all.,1999)( Intenet-2007)
A Pseudomonas e Plasmídios
Plasmídios a Pseudomonas aeruginosa possui na sua estrutura bacteriana estruturas
chamadas de plasmídios que são pequenas moléculas de DNA de forma circular,
cujo tamanho varia de 2 a
200 kb e segundo Boyd 1995, este tamanho é de
dez a cem vezes menor que, o do cromossoma da
bactéria. São geralmente condensados formando super hélices e estão presentes
nas células bacterianas em número de cópias de 1 a 20 segundo Vieira at al., 1996. Porém, Boyd
1995 afirma que o número de cópias pode ser de 1 a 100 presentes no citoplasma
bacteriano. Eles estão separados do genoma, ou seja; do cromossoma bacteriano e
não são controlados por ele e consequentemente se replicam autonomamente. Os
plasmídios estão divididos em duas classes os conjugativos e os não
conjugativos. Os conjugativos possuem genes relacionados com a formação do
pilus bacteriano e também a capacidade de gerarem cópias de si mesmos e
transferir elas para um outro receptor combinando com o seu genoma. Os
plasmídios não conjugativos mesmo não possuindo a sua própria capacidade de se
transferirem, eles também podem ser modificados e adquirirem a capacidade de
serem transferidos pelo mesmo processo de
transdução ou transformação ou conjugação, mas só no caso e em uma
última instancia se for necessário a bactéria e se ela possuir o plasmídio
conjugativo junto. Em seu DNA estão presentes os
genes que inativam diversos antibióticos,
conferindo ás bactérias que os possuem, uma resistência a esses medicamentos.
Neles existem enzimas de restrição e modificação capazes de modificar a sua
função primária. Possuem também a capacidade inserirem ao genoma do hospedeiro
atacado e nesse caso são conhecidos como transposons. Estes transposons possuem
seqüências complementares de inserção que se encaixam perfeitamente no genoma do
hospedeiro. De outra maneira também existe a possibilidade de se inserir
transposons no gene bacteriano e inativá-lo, pois estas inserções podem gerar
mutações. (Vieira et al., 1996).
Os Plasmídios e
a Construção de Mutantes
Recentemente para comprovar a mutação
produzida por plasmídios (Banin et al., 2005) trabalhando
com a construção de mutantes de Pseudomonas
aeruginosa utilizaram cepas armazenadas
de um banco de genética bacteriana catalogadas. Para
a construção de novos plasmídios mutantes, eles
utilizaram pedaços das extremidades tanto da extremidade inferior, como da extremidade superior da fita de cromossomos, de
várias cepas diferentes de Pseudomonas aeruginosa que foram colocados no interior
de um gene vetor extraído de outra bactéria pseudomonas e aí os pedaços de cromossomos foram associados, replicados e clonados
e depois ligados com plasmídio da Escheria
coli. O resultado foi que eles
conseguiram um novo plasmídio mutante com o plasmídio da Escheria coli combinado com
pedaços das extremidades de cromossomos das várias cepas
de Pseudomonas aeruginosa. A mutação foi confirmada pela análise laboratorial do PCR; ou Reação em Cadeia de
Polimerase, exame o qual tem por finalidade demonstrar a presença ou a ausência
de determinada seqüência de DNA de numa amostra
clínica. Lima et al., 2001. Foram ao mesmo tempo preparadas outras amostras
confirmatórias em paralelo que apresentaram a mesma forma de crescimento de
mutantes de plasmídios que foram o seguinte: Os pedaços inferiores de cromossomos de duas cepas
diferentes de Pseudomonas aeruginosa catalogadas do banco de genética, foram ligados com
outros dois pedaços superiores da cadeia do
cromossomo de outras duas cepas diferentes de Pseudomonas aeruginosa também catalogadas, estes
pedaços foram introduzidos num gene vetor extraído
de uma outra cepa diferente de Pseudomonas aeruginosa e assim os fragmentos terminais
dos cromossomos das Pseudomonas
aeruginosa foram ligados,
amplificados e clonados no interior do gene que fora extraído da outra pseudomonas, e após a ligação e amplificação desses cromossomos, estes foram ligados com plasmídio de Escherichia coli
e replicados, resultando na formação de um plasmídio com característica do gene vetor extraído de uma espécie de P. aeruginosa ligados com pedaços de
cromossomos de outras cepas diferentes de P. aeruginosa e ligados com plasmídios de Escherichia
coli. Essa transconjugação foi isolada e
a mutação foi confirmada pelos pesquisadores. (Banin et al., 2005).
Modelos
de Plasmidios
Modelo simplificado de um plásmídio que
possui a forma de um anel.
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Respiração
das Pseudomonas
A Respiração da Pseudomonas aeruginosa Pelo Oxigênio
A Pseudomonas
aeruginosa é um Microrganismo Aeróbico Obrigatório?
Uma
observação a ser feita é que a heme é um tetrâmero ou uma molécula que contém
ferro na forma ferroso, serve como uma coenzima numa variedade de processos
bioquímicos especialmente na estrutura heme da globina nos eritrócitos.
A Pseudomonas aeruginosa é um
microrganismo presente em toda parte é aeróbico obrigatório ela ganha grande
parte da energia através da respiração
aeróbica. Durante a respiração aeróbica o metabolismo transforma o dióxido de
oxigênio O2 em
oxigênio em um produto intermediário, ou superóxido O-, ou o peróxido de
hidrogênio (H2O2) nocivo possuindo um
efeito tóxico para a célula . É claro que o peróxido de hidrogênio sendo
altamente tóxico não poderia ficar contido no interior da bactéria em questão,
então o conteúdo tóxico desse produto da oxidação do oxigênio deveria ser
eliminado e os caminhos pelos quais isto ocorre foram descobertos por Scott e
colaboradores. A P. aeruginosa sofre uma desintoxicação ou uma eliminação
dessa toxina do seu organismo através de dois tipos de heme proteínas
denominadas de catalases, que são produzidas por elas mesmas as quais
desentoxica a bactéria do peróxido de hidrogênio (H2O2).
O estudo feito de como a catalase agiria na limpeza do microrganismo do
peróxido de hidrogênio foi feito da seguinte forma:
- foi tomado uma
parte do cromossomo mapeado da P. aeruginosa ; a parte do gene da Pseudomonas aeruginosa mapeada a
qual foi a região chamada ou denominada de KatB que continha porções dos genes
71 até a 75 desse cromossomo que já estava identificado esse gene foi clonado
na seguinte parte 5,4 kb do KatB o qual é o composto ECO RI que possui 1539 bp
que é o responsável pela codificação de 513 aminoácidos e responsável por 65 %
de toda catalase produzida. Esta experiência foi feito com a P. seryngae que é uma pseudomonas
vegetariana e compararam com a Pseudomonas
aeruginosa. (Scott
et al., 1995)
Comparação dos Testes Com
Genes de Pseudomonas e de Genes de Espécie Diferente Clonados e Obtenção dos
Resultados de Produção da Catalase
Para comparação
dos testes clonaram também uma cepa mutante e Escherichia coli denominada de cepa UM 255, e fizeram a
recombinação com o KatB da pseudomonas que expressava uma quantidade de 229 U/
mg de catalase uma forma muito resistente ao peróxido de hidrogênio, essa forma
é do tipo de E. coli HB 101 selvagem. A KatB nesse caso era purificada e
homogeneizada e determinado o tretrâmero que consistia em 228 KDa a qual
assimilou bem e promoveu a montagem do gene da proteína com a produção da
proteína KatB do tamanho normal. Uma outra observação feita foi que o KatB não
foi tão produzida durante o ciclo normal de crescimento da P. aeruginosa, e outro fato observado foi que a catalase se
desenvolveu com atividade maior para aquelas formas que não eram mucóides do
que das formas mucóides que são aquelas
que produz o alginato. A Pseudomonas aeruginosa é estritamente aeróbica
a qual possui alto s níveis de catalase com atividade específica, porém sendo
um microrganismo patógeno oportunista é responsável por altas porcentagens de
infecções nosocomiais; doença adquirida em hospitais porque o paciente se
apresenta mais susceptível ás infecções, especialmente em pacientes com
queimaduras, com doenças respiratórias ocorre a instalação de vários
microrganismos e especialmente a pseudomonas, com fibrose cística, e com CF
pulmonar (cápsula fibrosa) nas vias aéreas. Nesse caso, a pseudomonas é
expressamente uma terrível e considerável produtora do estresse oxidativo
exatamente porque esses pacientes precisam muito mais de oxigênio e parte desse
oxigênio é captado pela pseudomonas. No caso dos pacientes com doenças
respiratórias essas células necessitam do dobro de oxigênio e por isso consomem
duas vezes mais oxigênio do que as células normais, e com isso há o aumento da
produção de H2O2 e conseqüentemente o aumento da produção da catalase. (Scott et al., 1995)
As Superóxidos Dismutases Na Pseudomonas aeruginosa
Para a
complementação das várias etapas dos testes os pesquisadores, pegaram a região
do cromossomo que continha o gene o qual supunham sendo aquele o responsável
pelo efeito da desintoxicação. Observaram que havia na parte cromossômica duas
regiões que continham os genes responsáveis pela ação os quais foram
denominados pelas siglas: SodA e Sod B (superóxido dismutase) são genes que
codificam os peptídios. Está ligado ao
braço longo do cromossomo 21, esse mesmo gene tem a capacidade contra o
meniadone (que é a precursor da Vitamina K) e contra o peróxido de hidrogênio,
além disso tem um papel na captação do cádmio por células da saccharomices
cerevisae, o Sod encontra-se no cromossomo 21 e está associado a trissomia do
21 conhecido como síndrome de Dawn. A Sod A está associada ao superóxido
dismutase Mn- e ao plasmídio que pode carregar esse gene SodA. Esses genes
codificam em substratos o manganês e a superóxido dismutase do ferro também atuantes
na limpeza celular. Essas catalases possuem duas hemes ou enzimas denominadas
de catalases que são utilizadas na desintoxicação da Pseudomonas aeruginosa. A heme é importante no metabolismo
de um modo geral, porque se liga a proteínas que contém o grupo prostético. O
ferro é melhor absorvido na forma de heme oxidase, a heme participa sobre as
peroxidases atuando como um processo catalítico. As pseudomonas possuem as propriedades de se
ligar com os peptídios do citocromoC (é o transferidor de elétrons está ligado
á fosforilação oxidadativa. Na pseudomonas atua como peroxidases). O qual passa
a conter a catalase na qual é usada para desintoxicar a célula do peróxido de
hidrogênio. Além disso; a P.
aeruginosa possui um operon contendo glpF (é a estrutura do gene que
atua como facilitador da difusão do polipeptídio glicerol) o qual está
relacionado coma a região ,glpD e glpT
que possuem várias enzimas que desentoxicam a ROS (é um operon que contém glpF,
glpD, glpT) e agem como se fossem as catalases. Quando exposto a um excesso de
peróxido de hidrogênio essa elevação do nível desse composto passa a ser tão
alto, que a atividade da catalase aumenta numa proporção intensiva de 7 para 16
vezes envolvendo um desempenho muito maior dessa catalase respectivamente. Em
adição o aumento da atividade da KatB que foi promovido pelo forçado aumento de
H2O2 causou o registro de
um aumento da resistência ao peróxido de hidrogênio. A KatB foi localizada no
citoplasma, enquanto que a KatA foi
detectada em ambos os lugares no citoplasma e na parte do extrato
periplasmatico. A forma mutante da Pseudomonas
aeruginosa Kat B demonstrou que tem grande sensibilidade ao peróxido de
hidrogênio atuando em 50% desse composto da bactéria do tipo selvagem sugerindo
que a KatB é um ótimo e essencial composto para a resistência da Pseudomonas aeruginosa ao peróxido de hidrogênio exógeno. (Scott et al., 1995)
O Gene da Pseudomonas
aeruginosa
katB produz Ótima Resistência á H2O2
Uma Infecção nas
vias aéreas pode levar o paciente a ter a uma grande infiltração de neutrófilos
nessa parte do organismo e isso pode aumentar a produção local de H2O2 o que contribui
ainda mais com a virulência bacteriana. A Pseudomonas
aruginosa estimula a fagocitose e por conseqüência ocorre a migração de
fagócitos para a área de infecção essas células fagocíticas empregam o O2, e nesse caso ocorre
á redução desse oxigênio nos seguintes produtos nocivos á bactéria: O-. O O- é
um radical que incapacita muitas enzimas essenciais, uma delas é a sulfato de
ferro a qual é essencial para o
metabolismo celular. O H2O2 age através de
desmutação espontânea ou por via que desproporciona a ação da superóxido
dismutase SoDs causando aumento do H2O2 e
a sua livre difusão dentro da célula alterando o ∆p do potencial de membrana o
que pode causar um simples encalhamento ou corte no DNA levando-o a uma
mutação. E ainda a produção do radical hidroxila OH e ácido hipocloroso HOCl
que atua como agente antimicrobiano. Para conter o potencial de obstáculos que
ocorre com a elevação do nível de H2O2,
a maioria dos organismos aeróbicos possuem catalases de alto peso molecular,
contendo heme proteína a qual funciona na destruição da H2O2 deixando livre O2 e água os quais são
os produtos finais limpos. A catalase é muito importante para a desintoxicação
do H2O2 geralmente na parte
endógena bacteriana que usa a respiração aeróbica normal. A catalase também
pode atuar durante uma estimulação por uma infecção e nesse local ocorre a
destruição dos fagócitos que contém essas enzimas ou pelo redox ou ciclo da
piocianina, ou ainda pela produção sob condições em que o fosfato se torna
limitado aí ocorre a produção de um antibiótico específico gerado, pela
Pseudomonas aeruginosa o azul de fenazina.
Nos estudos
prévios de Hasset et all., Eles sugeriram que a P. aeruginosa produz múltiplas isozimas catalases sob as
mesmas condições em que o organismo produz a piocianina.Com base nas pesquisas
feitas com a P. syringae ela
possui sete isozimas catalases de base nativa. Isto foi comprovado através da
técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida ou eletroforese em gel.
E comprovaram que essas catalases eram necessárias
para as plantas durante a ocorrência de uma virulência nas plantas. Isso
confirma a permanência do importante papel da catalase em outras espécies
produtoras de H2O2. Porém ainda é
desconhecido as causas nos mutantes isogênicos devido a uma ou mais espécies de
catalases Kat genes que se tornam indisponíveis ás pesquisas por enquanto. Na
pesquisa realizada de um modo geral que empregara a genética de formação de
genes idênticos para os clones formados ficou muito bem esclarecido que o gene
kat B o gene da Pseudomonas
aeruginosa produz essencialmente uma ótima resistência á H2O2. (Scott et al.,1995)
A Capacidade de Produção da Catalase Pela Pseudomonas aeruginosa.
A Pseudomonas
aeruginosa em sua defesa, possui a capacidade de produção de mais de 1000 U/mg de
catalase de alto peso molecular. A seqüência da pesquisa foi feita com o
fragmento do DNA de duas espécies de bactérias que mostrou alto grau de
identidade entre si, essas duas espécies bactérias de genes que eram muito
parecidos foram pesquisados através da P. aeruginosa e da P.
syringae CatF.( é uma espécie de cris tal da Pseudomonas syringae, é o nome da catalase que
defende o microrganismo, e catF pode significar também o nome do gene da catalase denominado de 3-oxoadipyl -CoA
tiolase. E por fim a letra F que está associada ao Cat pode ter várias
designações para a Pseudomonas syringae mas a mais provável é de
ser a parte da proteína que mantém a estrutura integra da P.
syringae. (Ossonwsk e colaboradores). DNA da Pseudomonas aeruginosa o tipo PAO1 foi digerido
para a obtenção do fragmento de cromossomo a porção do genoma 273 bp PCR KatB
este fragmento do cromossomo foi mapeado e foi determinado pelo uso da técnica
de campo de pulso transverso em eletroforese em gel para a determinação e a localização dentro da
célula dessa KatA e da Kat B da Pseudomonas aeruginosa. Para essa técnica os
pesquisadores usaram glucose-6- fosfato–desidrogenase (uma enzima
citoplasmática que age tanto no citoplasma como no periplasma da célula e que
se associa a qualquer tipo de Kat como fora comprovado na experiência com o
extrato de katB tipo selvagem e de forma mutante).(Hasset
et al.,1995) As catalases
demonstraram regiões de alta homologia as quais facilitam a geração do 273–bp
(é uma expressão para a caracterização fenotípica na clonagem do genoma de um fragmento de DNA já conhecido e
marcado com o número 273-bp que
proporciona a replicação idêntica uma a outra devido a essas regiões de
homologia das catalases). KatB PCR ( é a caracterização que ocorre na clonagem do gene KatB da
pseudomonas aeruginosa, o PCR facilita a geração do 273 bp KatB para essa
bactéria). Todos os testes feitos e os produtos gerados comprovam que a
seqüência dos aminoácidos utilizados na montagem do katB da P. aeruginosa
possui alta identidade com o KatF da P. syringae. (Scott et al., 1995).
A
Descoberta dos Tipos De KatA e KatB e a Sua Relação com a SodA e SodB na Pseudomonas aeruginosa
O KatB e
SodA é um composto da Pseudomonas aeruginosa que transforma os produtos
da degradação do oxigênio. Como sabemos a oxidação pela Pseudomonas aeruginosa do oxigênio produz o superóxido, ou
peróxido de hidrogênio, e também o radical hidroxila. A primeira linha de
defesa contra os níveis desses produtos tóxicos de superóxido de hidrogênio é a
SOD( Superóxido dismutase). Existem dois tipos de SOD a Sod A e a SodB.
A Sod A codifica o manganês como cofator de ação contra o peróxido de
hidrogênio ou os produtos tóxicos contra a bactéria. A SodB codifica o ferro
como cofator ferro dismutase contra a toxicidade bacteriana. Podemos também
definir que a CatB
é a catalase e o Sod A é a porção dos genes
que se caracterizam através de clonagens experimentalmente feitas em
laboratório para estudar essa duas formas de Sod a clonagem da Sod A confirmou ser
a responsável na codificação do cofator manganês e a SodB da P. aeruginosa
também demonstrou ser a responsável pela produção do superóxido Ferro dismutase.
Em conclusão os
pesquisadores trabalharam que com o coadjuvante no desenvolvimento da
resistência da P. aeruginosa o composto paraquat. Foi usado em cepas que não
continham nenhuma resistência ao peróxido de hidrogênio e com a adição de 100
μM do reagente paraquat essa cepa passou a adquirir resistência ao peróxido de
hidrogênio. Outra cepa selvagem a qual não foi usado o paraquat não adquiriu
resistência á peroxidase. Também com a técnica de campo de pulso transverso em
eletroforese em gel, foi demonstrado a localização dos dois compostos Kata e
katB na célula.
Efeitos
da Temperatura e do pH Sobre A Catalase da P.
aeruginosa
O efeito
da temperatura e pH na katB purificada. Foram estáveis na temperatrura de 0 a 37ºC sobre o efeito da
catalase KatB. Contudo a exposição de katB por uma hora a 55ºC mostrou uma
redução da atividade em 83%. Com completa perda de atividade quando é exposta á
temperatura de 60 ºC.
O pH ótimo
está entre 7 e 9,5 para a katB, já o pH 3,0 inativa a enzima ou a deixa com uma
fraca atividade de atuação de apenas 3%, O pH ideal está entre 8 e 12,1.
O mutante
da KatB da Pseudomonas aeruginosa
demonstra sensibilidade a altos níveis de exposição de H2O2. Foi uma
experiência em cultura em caldo com KatB e Pseudomonas aeruginosa marcadas e
resistente ao H2O2 FRD2 katB onde cresceram aerobicamente em L. caldo com 100 μM de paraquat
que induz a síntese de KatB no tipo selvagem da bactéria. Como esperávamos
pré-expusemos outra cultura selvagem FRD2 de P. aeruginosa mas, sem o paraquat o resultado foi o seguinte :
a primeira possuindo KatB induzido demonstrou atividade da catalase. Já segunda
forma a qual estava sem o paraquat não demonstrou sensibilidade da
catalase.
A
Pseudomonas aeruginosa ganha grande parte de sua energia através da respiração
aeróbca, porém ela produz O- e H2O2 e também OH-. Para combater esses produtos
tóxicos para ela esta possui antioxidantes na forma de SODs, catalases e
peroxidases, ou ainda aproveitando substratos como o glutation, ascorbato e
manganês ++ que formam uma linha de proteção contra a H2O2. a experiência em gel
eletroforese demonstrou que as atividades das múltiplas catalases não são
desnaturadas quando se reduz a extrato as células em estudo para retirar delas
a catalase , isso é importante porque a catalase da p. aeruginosa não perde a função
de resistência.
Respiração da Pseudomonas
aeruginosa Utilização do Nitrogênio
Uma das Vias Utilizadas é Utilização do
Nitrogênio Endógeno Para a Respiração Bacteriana
Há
décadas é reconhecido que o nitrogênio endógeno é utilizado como substrato para
a respiração da pseudomonas aeruginosa. (J. bact. 86: 58-66, 1963) .O Nitrogênio da
reserva natural é utilizado pela bactéria e é oxidado durante a respiração
endógena. Isto foi estudado através da técnica de radioimunoensaio. Os
constituintes químicos e a distribuição dessa radioatividade por toda a
estrutura celular levou a conhecer a importância da utilização do nitrogênio
quando a bactéria estava passando por um período fome induzida ou a provocação
de uma baixa na oxidação. O estudo dessas células bacterianas que passavam por
um período de deficiência dos compostos utilizados na produção de energia e da
diminuição da oxidação foram marcadas com substrato com carbono 14 radioativo.
Durante esses testes foram observados através da ação do carbono quatorze,
ficou claro o modo de como elas procediam para obterem o alimento energético
que foi utilizado durante a experiência
com o regime oxidativo imposto durante o teste. Ficou demonstrado que houve
várias mudanças químicas necessários dos compostos constituintes da estrutura
bacteriana que foi demonstrado através da distribuição e da assimilação da
radioatividade do carbono 14. E comprovaram as mudanças através da necessidade
da nutrição celular que tinha sido cada vez mais solicitada pelo microrganismo,
á medida que os compostos aproveitáveis ao metabolismo celular iam acabando – o
substrato marcado com carbono 14começou a se espalhar tomando o lugar da falta
de alimentos o que possibilitou a leitura através do teste de radioimunoensaio.(Audrey et al., 1961).
Extração
de Nitrogênio do DNA do RNA e de Outras Proteínas da Estrutura Bacteriana
Com o
teste ficou comprovado que houve a diminuição do número total proteínas
importantes da estrutura celular e de partes e ácidos nucléicos os quais
possuem compostos nitrogenados. Houve uma observação da diminuição visível dos
ácidos nucleicos de Warburg Vessel que decrescia cada vez mais seu conteúdo
durante a decrescente presença da subalimentação. O ácido desoxirribonucléico
(DNA) também diminui levemente. Enquanto o ácido ribonucléico (RNA )diminuiu
ainda mais,como foi mostrado pelo C14 e o O2 que também estava envolvido com a respiração
endógena ou com a parte da célula ou da
fração do ácido nucléico em estudo, especificamente nessa célula que se mostrou
ter um decréscimo em termos de calorias. Através do uso da solução de ácido
tricloroacético que é um ácido tóxico e venenoso para os organismos de um modo
em geral, em testes, esse ácido causou a hidrolização do peptídio de ligação
das proteínas da caseína. Também é de importância conhecer que o ácido
tricloroacético pode ser usado por dermatologistas para descamação da pele. Em
tratamento de condilomas o que faz a lesão secar e desaparecer. Mas
especialmente quanto á ação sobre as proteínas causa a separação dos peptídios.
Atualmente o ácido tricloroacético pode ser usado em testes laboratoriais para
lesar interferons. Mas o principal fato nesta pesquisa foi a de causar a
solubilidade do nitrogênio; foi tornar o nitrogênio solúvel causando a
proteólise celular mais intensa. Houve a
degradação do RNA e a sua solubilidade e também da solubilidade do pool de
componentes de proteínas livres solúveis e insolúveis celular, o que foi
indicada através do aumento local do nitrogênio marcado com o C14 e O2 aparecia
ou originava especificamente da proteína degradada .
O
decréscimo do RNA ribossomal e das proteínas marcadas das células em estudo. Demonstrou
mais que um tipo de enzima responsável pela degradação ribossomal, foram
detectados quando as pesquisas direcionaram á
associação da degradação de uma fração do ribossomo que estava em decomposição. Isto
levou a conclusão que a oxidação das proteínas do ribonúcleo durante a
respiração endógena pode ser fenômeno que ocorre em geral nesses microrganismos.
O nitrogênio ficou comprovado que é usado como substrato na respiração da
Pseudomonas aeruginosa. Esse nitrogênio provém dos ácidos nucleicos e ácidos
desoxirribonucléico e além do mais provoca uma enorme diminuição do RNA
ribossomal e de outras proteínas da célula. Tudo isto sugere que os
microrganismos não possuem uma reserva específica de nitrogênio ou de carbono.
O mesmo teste comprovou que há um grande número de enzimas que participam da
respiração endógena do microrganismo pois, quando os nutrientes são recompostos nas células em
regime e co falta de nutrientes é requerido um número muito grande dessas novas
enzimas para reestruturarem os aminoácidos da célula. (Audrey et al.,1961).
Processo de Germinação Da Pseudomonas
Aeruginosa
O Efeito do Cloreto de Cálcio
Experiência feitas com
camundongos em que foram administrado solução de cloreto de cálcio misturada
com duas cepas diferentes de Pseudomonas
aeruginosa aumentou
a virulência dessas bactérias, isto foi comprovado quando se observou o
aumentou da virulência para algumas formas de pseudomonas. Foi usado uma
solução preparada a 50% da dose letal da solução de cloreto de sódio misturada
com Pseudomonas aeruginosa, fora aplicada por via intramuscular, subcutânea e intraperitonial. Nos
camundongos em que foram aplicados as formas de número 5 houve um decréscimo no
poder da infecção. Isto comprovou que a forma denominada de número 5 causou
menos infecção. A experiência foi feita por mais de 3 ordens e nos mesmos
locais de aplicação as formas de solução de mesma magnitude que não teve nenhum
motivo para ser considerável pois os efeitos não foram tão devastadores. Outra
solução preparada de 10.000 microrganismos da forma número 5 juntamente com a
forma N 10 misturada com cloreto de cálcio, ambas essas formas provocaram uma
virulência muito forte e se multiplicaram no local da injeção. A forma 5
subsequentemente observada causou infecção sistêmica enquanto a forma N 10 não
pode causar a mesma infecção. A virulência comprovadamente aumentou o efeito
com o cloreto de cálcio. Porém a mesma solução pode ser sucessivamente aplicada
em processos de ensaios em camundongos imunizados com a forma 5 modificada sem
causar infecção. (Yutaka et al.,1985)
A Divisão Celular Na Pseudomonas
aeruginosa com a Participação da Fosfatase Alcalina
Teste Feito Com a Inativação
do Filamento de Cromossomo da Pseudomonas aeruginosa Para
Compreender Seu Efeito de Reconstrução Celular Mesmo Sob Grande Estresse
Mesmo quando você inativa um
filamento do cromossomo de qualquer uma das bactérias, no nosso caso a P.
aeruginosa; essa inativação pode ser feita através de radiação
ultravioleta, através de alta temperatura, através de produtos químicos assim
como os antibióticos, o resultado será sempre a inativação de certas enzimas, o
que irá causar na estrutura bacteriana mudanças como a mudança da
permeabilidade da parede celular, ou a síntese de ácido desoxirribonucléico.
Demonstrações feitas com o filamento do DNA da Pseudomonas aeruginosa, a cepa
ATCC9021 à temperatura extremas e a temperatura normal, com produtos químicos
como o emprego da fosfatase alcalina e o emprego da lisozima. Todos esses
testes revelaram que toda utilização desse aparato físicos químicos também
implicou na obtenção de uma resposta e demonstração de um papel importante no
ciclo ou divisão celular.
Para demonstrar a ocorrência
desses fatores nessa bactéria foi feito teste de dosagem espectrofotométrica,
em 660 nm. Uma outra preparação feita com compostos químicos foi lida em outro
comprimento de onda; a leitura foi feita em espectrofotômetro em 300 nm. Uma
outra técnica empregada foi feita por lâmina de microscopia eletrônica de cintilografia.
Efeito da Temperatura Na formação Celular
Foi feito testes sobre o crescimento da Pseudomonas
aeruginosa coma a fosfatase alcalina sob condições de temperatura
normal e temperatura extrema. A P.
Aeruginosa cresce com uma taxa aparentemente reduzida na temperatura de 46ºC
que foi comparado com uma cepa que cresceu na temperatura de 37ºC. Esse
crescimento foi comparado em teste de absorbância. As células que cresceram a
46 ºC foram obtidas de filamentos plasmolizados longos e sem mobilidade. Os
filamentos contendo uma fase naturalmente escura que poderia ser o cromossomo
“in natura”. Quando colocado a 46ºC a
cultura foi mudada para 37 ºC, os fragmentos dos filamentos dessa parte polar
do filamento, ou seja; da sua terminação terminou formando o flagelo da
bactéria, e o número final de células formadas com o uso dos filamentos foi
igual ao número dos pacotes de cromossomos empregados nos testes foram observados.
A Formação Celular Quando A Parte
Cromossômica Foi Tratada com Lisozima
Foi usado um outro pacote de filamentos o
qual parecia ser estruturalmente completo que foi tratado com lisozimas, e
incubados como foi determinado e foi feita investigação bioquímica, de uma fina
secção congelada e examinada ao microscópio que revelou a formação de grandes
esferoplastos. A conclusão em que chegaram os pesquisadores que sugeriram que
esta parte do filamento é a responsável pela formação da parte externa da
membrana citoplasmática a qual é construída por pedaços de um genótipo ou seja,
a parte contínua do filamento do cromossomo.
A Formação Celular Quando Foi Adicionado
Fosfatase Alcalina ao Meio de Crescimento
Outro filamento estudado foi tratado com
fosfatase alcalina (Apase) essa parte produziu o que parecia ser o periplasma
da célula, porém apresentaram alguma atividade imediatamente após uma mudança a
37ºC. As células que cresceram e Foram mudadas para 46ºC permaneceram como
bastonetes imóveis ou apenas duplos bastões e a Apase formada a 37 ºC permaneceu estável a 46ºC. A
adição da Apase inorgânica ou seja com fosfato alcalino parcialmente adicionado
ou ás vezes completado com um indutor da fragmentação do filamento a 46ºC. A
adição da Atpase inorgânica e fosfatase
parcialmente ou completada efetivamente com um indutor da fragmentação
do filamento a 46ºC . O resultado sugere que o periplasma é o local em que a
atpase age e é importante enzima do estágio final da divisão celular, quando a
Pseudomonas aeruginosa é cultivada em fosfato inogânico num meio totalmente
controlado.
Fatores de Virulência da Pseudomonas
aeruginosa
Os Vários Fatores de Virulência das Pseudomonas
As bactérias do gênero pseudomonas
especialmente a Pseudomonas aeruginosa, possui vários fatores de
virulência que aumenta ainda mais a sua patogenicidade, esta apresenta três
tipos de antígenos. Um antígeno é o “O” que é somático, o outro é o antígeno
“H” que é flagelar, e possui ainda um terceiro tipo de antígeno que é o “M” ou
seja; micóide. ( Merino et al., 2002). O
antígeno “O” é específico da espécie microbiana que possui a estrutura celular
que envolve a liberação de toxinas e enzimas com propriedades distintas de
atuação sobre os mecanismos de defesa do hospedeiro, mecanismos estes de
agressão como a elastase que passa a atuar sobre a elastina a promotora da
união entre as células, a Exotoxina A que tem a capacidade de inibir a síntese
protéica de células hepáticas, coração, rim, pulmão e baço, ela é capaz de
inibir a captação dos aminoácidos a nível celular. Possui também uma citotoxina
capaz de atuar na maioria das células eucarióticas produzindo desordens nas
membranas. Uma outra exotoxina, a Exotoxina B contribui para o agravamento da
patogenicidade, e além disso possui enzimas que atuam sobre a elastase nas
células das paredes arteriais e sobre a colagenase da córnea produzindo
infecção local. (Lopes et al., 2002).
Texto Antonio Spereta Rocha
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